BAB
I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Kimia analitik adalah
cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis material untuk mengetahui
komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara tradisional, kimia analitik
dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif
bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau senyawa kimia, baik
organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk
mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan (Eka, 2013).
Metode
pemisahan kromatografi dapat dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kadar
zat/analit dalam sampel. Analisis kuantitatif kromatogram dapat dilakukan dengan
berbagai cara, seperti analisis tinggi puncak, menghitung luas puncak, dan
metode gunting & timbang. Metode gunting timbang dapat dilakukan jika
puncak-puncak yang diperoleh kurang ideal, misal puncak-puncak tersebut
mengalami pelebaran.
Kromatogram
yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian
guntingan-guntingan kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari masing-maisng
guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk
kromatogram tersebut (Akhmad, 2018).
KCKT paling
sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti
asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan
fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping
proses sintetis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor
sampel-sampel yang berasal dari lingkungan ; memurnikan senyawa-senyawa dalam
suatu campuran ; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya
dalam suatu campuran; kontrol kualitas dan mengikuti jalannya reaksi sintetis (Eka, 2013).
1.2
Rumusan Masalah
Bagaimana
mengkuantisasi analit berdasarkan kromatogram?
1.3
Tujuan Penulisan
Mahasiswa
mampu mengkuantisasi analit berdasarkan kromatogram.
BAB
II
DASAR TEORI
2.1 Analisis
HPLC
Teknik
HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik
untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif
dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar (Sumar,
1994).
Tehnik pemisahan
dalam kromatografi melibatkan dua fasa, yakni fasa diam yaitu padat atau cairan
yang terikat pada padatan pendukung, dan fasa gerak yang berupa gas dan cair. Proses pemisahan dalam
kromatografi di dasarkan pada perbedaan laju migrasi masing- masing komponen
dalam sistem kromatografi. Perbedaan laju migrasi dari masing-masing komponen
merupakan akibat dari perbedaan keseimbangan distribusi masing-masing komponen
diantara fasa gerak dan fasa diam. Metode kromatografi dibedakan dalam beberapa
macam, berdasar pada fasa gerak, fasa diam, mekanisme, dan tehnik yang
digunakan dan salah satu diantaranya adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(HPLC).
Dalam kromatografi
cair Kinerja tinggi ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa
diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut). Maksud dan tujuan analisis
dengan kromatografi yaitu didapatnya pemisahan yang baik demikian halnya dalam
HPLC diharapkan pemisahannya baik dan dalam waktu proses yang relative singkat.
Untuk mencapai Tujuan analisis ini, maka dipilih pelarut pengembang yang sesuai
dengan komponen yang dipisahkan, kolom yang digunakan juga harus diperhatikan,
dan detector yang memadai (Eka, 2013).
2.2 Prinsip
Kerja HPLC/KCKT
Adapun
prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut
terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak
dan fase diam (Eka, 2013).
2.3 Kegunaan
HPLC/KCKT
Kegunaan
umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities)
; analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil) ; penentuan
molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion ; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak dan
dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Eka, 2013).
2.4 Mekanisme
Kerja HPLC/KCKT
Gambar 1.
Instrumen HPLC
Penggunaan kromatografi
cair membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi
operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepataan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel. Skema dan fungsi setiap komponen instrumen HPLC yaitu (Sumar, 1994)
:
1.
Solvent
reservoist
2.
Solvent
degasser
3.
Gradient
valve
4.
Mixing
vassel
5.
Pompa
bertekanan tinggi
6.
Switching
valve dalam"inject position" dan 6’. Switching valve dalam "load
position"
7.
Sample
injection loop
8.
Pre-column
9.
Analytical
column
10. Detektor
11. Data acquisition
12. Waste of fraction collector
Beberapa
parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah (Rafizanisa,
2009) :
a.
Kolom
Sebuah kolom sederhana memiliki
diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150
sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom
fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non
polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya
secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
b.
Komposisi
Eluen
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat
dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan
sampling value.
c.
Detektor
Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik
kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi
lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.
d.
Chart
Speed
Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel
diinjeksikan secara manual.
2.5 Jenis-Jenis
HPLC/KCKT
Menurut Eka (2013) mengatakan bahwa
jenis-jenis kromatografi cair kinerja tinggi ada 3 (tiga) yaitu :
·
Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat
cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Jenis
kromatografi ini menggunakan fasa gerak non polar seperti heksana dan disebut
jugakromatografi fasa normal.
·
Kromatografi partisi
Kromatografi partisi sangat
cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa non polar. Jenis kromatografi ini disebut
dengan kromatografi fasa terbalik karena fasa geraknya lebih polar
daripada fasa diam. Salah satu
kendala kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai
ketidakcampuran kedua fasa. Karena
keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak digunakan lagi sebagai teknik
analisis rutin.
·
Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat
merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan saat ini.
Dalam hal penerapann kromatografi fasa terikat
dan kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi, sorben fasa terbalik
terdiri dari partikel silika yang dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil
sebaliknya, fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel yang
dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.
2.6 Kelebihan
dan Kekurangan Metode HPLC
Menurut Eka (2013),
mengatakan bahwa metode HPLC juga memiliki kelebihan dan kekurangan di
antaranya yaitu :
a. Kelebihan
HPLC
-
Mampu memisahkan molekul-
molekul dari suatu campuran.
-
Mudah melaksanakannya.
-
Kecepatan analisis dan kepekaan
yang tinggi.
-
Dapat dihindari terjadinya
dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik.
-
Dapat digunakan bermacam-
macam detector.
-
Kolom dapat digunakan kembali.
-
Mudah melakukan "sample
recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada
HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
-
Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi
karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
-
Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
-
Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik
didihnya sangat tinggi seperti polimer
-
Dapat
memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas
-
Banyak pilihan fasa geraknya
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
-
Resolusi : Berbeda dengan KG,
Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi.
Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
-
Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
-
Sensitivitas detektor :
Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi kadar
dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.
-
Detektor- detektor Fluoresensi
dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).
Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri,
dll, dapat juga digunakan dalam HPLC
-
Kolom
yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
HPLC dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
-
Ideal untuk zat bermolekul
besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena
volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik.
HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –
zat tersebut.
-
Mudah
rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detector.
-
Solvennya dapat dihilangkan
dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
b. Kekurangan
HPLC
-
Larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu
-
Hanya bisa digunakan untuk
asam organic
-
Harus mengetahui kombinasi
yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
-
Harganya mahal sehingga
penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
BAB
III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan
Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari
Sabtu, 20 Oktober 2018 pukul 09.40-11.20 WIB di Laboratorium Farmasi Fakultas
Ilmu Kesehatan Universitas Nahdlatul Ulama Sunan Giri Bojonegoro.
3.2 Alat dan
Bahan
·
Alat
yang digunakan pada praktikum Analisis Kromatogram adalah :
-
Gunting 1
buah
-
Timbangan 1
buah
-
Penggaris 1
buah
-
Pensil
1
buah
·
Bahan
yang digunakan pada praktikum Analisis Kromatogram adalah :
-
Kertas
secukupnya
-
Kromatogram secukupnya
3.3 Langkah
Kerja
Langkah kerja yang dilakukan pada
praktikum Analisis Kromatogram adalah :
1.
Mencetak
kromatogram di dlembar kertas.
2.
Menyalin
kromatogram di kertas yang lebih tebal.
3.
Menggunting
masing-maisng puncak dalam kromatogram tersebut.
4.
Menimbang
untuk masing-masing puncak dan mencatat masanya.
5.
Menentukan
kadar masing-masing analit dalam campuran.
BAB
IV
PEMBAHASAN
4.1 Data Hasil
Pengamatan
4.1.1
Kromatogram 1
|
No.
|
Analit
|
Berat
(mg)
|
Kadar
(%)
|
|
1.
|
Fluoride
|
100 mg
|
5,9%
|
|
2.
|
Chloride
|
600 mg
|
35,3%
|
|
3.
|
Nitrite
|
300 mg
|
17,6%
|
|
4.
|
Bromide
|
100 mg
|
5,9%
|
|
5.
|
Sulfate
|
200 mg
|
11,8%
|
|
6.
|
Nitrate
|
200 mg
|
11,8%
|
|
7.
|
Phosphate
|
200 mg
|
11,8%
|
|
Total
|
1700
mg
|
100,1%
|
|
4.1.2 Kromatogram 2
|
No.
|
Analit
|
Berat
(gr)
|
Kadar
(%)
|
|
1.
|
Fucose (ISTD)
|
1200 mg
|
34,3%
|
|
2.
|
Arabinose
|
100 mg
|
2,9%
|
|
3.
|
Galactose
|
300 mg
|
8,6%
|
|
4.
|
Glucose
|
1400 mg
|
40%
|
|
5.
|
Xylose
|
300 mg
|
8,6%
|
|
6.
|
Mannose
|
200 mg
|
5,7%
|
|
Total
|
3500
gram
|
100,1%
|
|
4.2 Pembahasan
Pada
praktikum kali ini membahas tentang kuantitasi analit berdasarkan kromatogram.
Analisis kuantitatif kromatogram dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah
satunya adalah dengan metode gunting dan timbang. Metode ini dilakukan jika
puncak-puncak yang diperoleh kurang ideal, misal puncak-puncak tersebut
mengalami pelebaran (Akhmad, 2018). Dari percobaan tersebut, diperoleh hasil
seperti yang terdapat pada tabel di atas. Kadar (%) diperoleh dengan cara
membagi berat (gr) analit dengan jumlah total berat semua analit dikali 100%.
Atau dengan rumus :
|
Pada
kromatogram 1, analit yang mempunyai kadar zat paling banyak adalah Chloride
dengan berat 600mg dan kadar 35,3%. Sedangkan analit yang mempunyai kadar zat
paling sedikit adalah Fluoride dan Bromide dengan berat masing-masing 100mg dan
kadar 5,9%.
Pada kromatogram 2, analit yang mempunyai kadar zat paling banyak
adalah Glucose dengan berat 1400mg dan kadar 40%. Sedangkan analit yang
mempunyai kadar zat paling sedikit adalah Arabinose dengan berat 100mg dan
kadar 2,9%. Pada analit Rhamnose tidak ikut diperhitungkan karena puncak
kromatogramnya sangat kecil sehingga susah dihitung.
BAB
V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Metode pemisahan kromatografi dapat dianalisis seara kualitatif dan
kuantitatif. Analisis kuantitatif dapat dilakukan dngan tujuan untuk mengetahui
kadar zat/analit dalam sampel. Analisis kuantitatif kromatogram dapat dilakukan
dengan berbagai cara, salah satunya yaitu metode gunting dan timbang.
Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya,
kemudian guntingan-guntingan kertas kromatogram ini ditimbang. Berat dari
masing-masing guntingan kromatogram ini akan sebanding dengan senyawa yang
membentuk kromatogram tersebut.
5.2 Saran
Sebaiknya lebih ditertibkan lagi saat praktikum. Agar praktikum
bisa lebih maksimal dan hasil yang didapatkan sesuai dengan apa yang
diharapkan.
DAFTAR PUSTAKA
Al-Bari, Akhmad. 2018. Petunjuk Praktikum Kimia Analisis.
Jurusan Farmasi : Bojonegoro.
Andrian, Eka. 2013. HPLC. Diakses pada tanggal 27 November
2018. http://ekaandrians.blogspot.com/2013/04/hplc.html
Anonim, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat
dengan HPLC. Diakses pada tanggal 27 November 2018. http://cuprittrappedonlab.blogspot.com/2010/01/menghitung-kadar-parasetamol-dalam-obat.html
Fahmi, Rafizanisa. 2009. Analisis HPLC dan Aplikasinya.
Diakses pada tanggal 27 November 2018. http://rafizanisa.blogspot.com/2009/12/analisis-hplc-dan-aplikasinya.html
Hendayana, Sumar. (1994). Kimia Analitik Instrumen.
Semarang: IKIP Semarang Press.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar